RNA成像技术是可视化和动态追踪基因表达的重要工具。虽然基于噬菌体MS2的外壳蛋白（MCP）系统（MS2-MCP）被广泛应用活细胞RNA可视化和动态追踪，但是该技术在高等脊椎动物胚胎中的应用依赖遗传操作将串联重复的MS2序列插入到靶标基因组中，耗时较长且MS2序列插入可能改变靶标RNA的折叠。

来源于细菌或古菌中抵抗外源病毒的CRISPR-Cas13系统通过guide RNA（gRNA）引导直接靶向单链RNA。最近，酶活突变Cas13（dCas13）被开发用于活细胞RNA成像。然而该系统能否在多细胞生物中标记内源RNA尚未可知。由于大多数RNA追踪研究都在体外培养的细胞中进行，建立无需遗传操作的CRISPR-dCas13系统在多细胞生物中理解in vivo基因转录的动态变化和mRNA运动具有重要意义。

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2023年1月19日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）陈玲玲研究组在 Genome Biology期刊发表了题为：CRISPR-dCas13-tracing reveals transcriptional memory and limited mRNA export in developing zebrafish embryos 的研究论文。

该研究通过筛选和优化CRISPR-dCas13系统，在斑马鱼胚胎中实现内源mRNA的时空追踪，并揭示等位基因转录和mRNP运动的特征，为在多细胞生物体内可视化内源RNA提供强大工具。

为了实现内源mRNA的可视化，研究团队在体外纯化一系列融合荧光蛋白EGFP的dCas13（dCas13-EGFP）并合成相应的gRNA，通过靶标外源表达的24×GCN4 RNA，以及成像观察和单分子荧光原位杂交验证标记的RNA信号，筛选获得有效的CRISPR-dCas13系统（图1a）。

图1：在斑马鱼胚胎中建立CRISPR-dCas13系统的策略

进一步，cyanine 3（Cy3）或2′-O-methyl 3′phosphorothioate（MS）修饰的gRNA（图1b），被证明显著提高CRISPR-dCas13系统的标记能力。最终，利用优化的CRISPR-dCas13系统，并通过筛选具有重复序列的转录本作为靶标，研究团队发现dPspCas13b和dRfxCas13d都能够可视化内源eppk1基因的转录位点。该系统不仅可以标记其它内源mRNA，例如100537515 和 muc5.1，而且dPspCas13b和dRfxCas13d的联合使用可以实现内源mRNA的双色标记。

图2：利用CRISPR-dCas13系统在斑马鱼胚胎中观察从头起始转录和mRNP运动

此外，利用该系统追踪转录后mRNP的运动，研究人员发现CRISPR-dCas13标记的内源mRNP运动主要存在受限运动和自由扩散两种形式。在追踪mRNP出核过程中（图2），CRISPR-dCas13标记的mRNP出核时间表现高度的波动性，mRNP的出核受到限制，在核内发生累积。过表达出核相关因子Alyref和Nxf1可以明显缩短出核mRNP的时间、减少其在核内的累积。

综上所述，该研究通过在斑马鱼胚胎中建立耗时短和优化的CRISPR-dCas13系统，首次在多细胞生物体内不依赖于遗传操作，直接观察并追踪内源mRNA转录和mRNP出核。该系统的高效RNA标记能力得以在二倍体生物中同时观察两个等位基因的转录，并在连续的两个细胞周期中追踪等位基因间的从头起始转录和转录再激活的动态变化，表明在发育的胚胎中转录记忆可能作为潜在的分子机制介导等位基因间高度异质性的从头起始转录向同质化的转录再激活转变；该系统的高时空分辨率追踪到mRNP在细胞核质中快速运动以及出核的过程；该系统的独特优势推动我人们对多细胞生物中内源转录动力学以及mRNP运动和出核特性的理解。未来，CRISPR-dCas13系统仍有待进一步改进，包括建立有效的gRNA设计策略，实现不含重复序列转录本的标记等。

中科院分子细胞卓越中心陈玲玲研究组的博士后黄友葵为论文第一作者，陈玲玲研究员为通讯作者。该研究的合作者包括复旦大学生物医学研究院杨力研究员、中科院生物大分子卓越创新中心李栋研究员，该研究同时得到科技部、中科院稳定支持基础研究领域青年团队项目、国家自然科学基金委、上海市科委、分子细胞卓越中心、霍华德·休斯医学研究所、科学探索奖以及中国博士后科学基金等项目的资助。

论文链接：

关键词： 陈玲玲团队利用CRISPR-dCas13系统 实现内源mRNA时空追踪